彗星电泳法检测细胞损伤试剂盒 彗星法 DNA 损伤检测试剂盒 （ Comet Assay for DNA Damage Detection Kit） Cat number：KGA For Research Use Only Store at4℃ for one year Expire date： 一、试剂盒说明 DNA在自由基（如·OH）的攻击下容易发生损伤，即脱氧戊糖遭到破坏，磷酸二脂键的断裂，碱基的破坏或脱落，便可进一步产生单链断裂或双链断裂。将细胞固定于低熔点琼脂糖中，取少量细胞涂在载玻片上，用碱高盐溶液破坏细胞膜，再用碱溶液使DNA分子解旋。将载玻片置于电泳液中，在电场的作用下，DNA分子向阳极移动。如果DNA损伤严重，碎片多，则电泳速度快。未受损伤的DNA大分子则由于细胞膜的阻隔，滞留在原处。用PI染色或银染，可观察到DNA受损的细胞形同彗星现象，作定性分析。也可用相关的软件作定量分析。 二、试剂盒组份 | 组份 | Cat: KGA240（20 assays） | 储存条件 | | Lysis Bufffer | 100 mL | 4℃ | | DMSO | 8 mL | 4℃ | | 正常熔点琼脂糖NMA | 30 mg | 4℃ | | 低溶点琼脂糖LMA | 30 mg | 4℃ | | Propidium Iodide （PI） | 400μL | 4℃避光 | 三、 Kit以外自备仪器和试剂 低速离心机 、水平电泳仪、荧光显微镜、370C、450C水浴、载玻片、盖玻片、平皿、微量移液器、1.5m L Microtube、0.4mmol/LTris-HCl（pH7.5）缓冲液、PBS 四、注意事项 Propidium Iodide （PI）和EB有毒，操作时要戴手套。 五、操作方法 1．细胞用冰冷的PBS洗一次，离心收集，用PBS重悬使其密度为1×106个/mL； 2．铺胶： 下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS配制 第1层凝胶的制备：:将载玻片的磨砂面向上，40℃预热，将预热45℃的100μL的0.5%正常熔点琼脂糖（NMA）铺于载玻片上，盖上干净的盖玻片，再置4℃下10min使NMA凝固。 第2层凝胶的制备：:将10μL细胞（约 104个）和75μL的0.7%低溶点琼脂糖LMA（在37℃下水浴加热至少20min使之*溶化）混合均匀。然后，轻轻揭去盖玻片，迅速将含细胞的LMA滴到第1层琼脂糖上，立即盖上另一干净盖玻片，置4℃10min使第2层LMA凝固。 第3层凝胶的铺制：:第2层LMA凝固后，在室温下小心移去盖玻片，滴加预热37℃的75μL的0.7%低溶点琼脂糖LMA，如上盖上盖玻片4℃下凝固（第三层覆盖第二层周围0.5mm，增加凝胶化作用时间至30min，高湿度环境）。 3．细胞裂解 移去盖玻片，将玻片置于平皿中,倒入预冷的Lysis Bufffer （使用前每9 mL加入1 mL的DMSO）， 4℃裂解1～2h，取出载玻片用PBS漂洗。 4．DNA碱解旋 将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的碱性电泳缓冲液（用户自备1mmol/L EDTA,300mmol/L NaOH），约覆过载玻片胶面0.25cm左右，室温放置20～60min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使DNA断链在电场中易于迁移。 5．单细胞电泳 在电压25V，电泳20～30min，电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节。 6．中和与染色 电泳后将载玻片置于平皿内。加入0.4mmol/LTris-HCl（pH7.5）缓冲液，将载玻片没入，4℃中和三次，每次10min，弃去Tris-HCl缓冲液，每载玻片加20μL的PI染液或EB染液，盖上盖玻片，避光染色10min。 7．观察、拍照和分析 荧光显微镜515～560nm波长的激发光、PI染色的DNA图象呈红色，EB染色的DNA图象呈桔红色，可清楚地观察到核DNA和迁移的DNA（即慧星尾）。每个样本随机选择100个细胞，测定核DNA直径和DNA迁移的长度，可并用相应的软件分析。DNA损伤按彗星尾部DNA量占全部DNA量的比例分为5级： 0级： ＜ 5% 无损伤； 1级 5~20% 轻度损伤；2级 20~40% 中度损伤；3级 40~95% 高度损伤；4级 ＞95% 重度损伤 |
