|
|
|
|
|
 |
|
|
牛甘胆酸（CG）ELISA检测试剂盒说明书 |
| 点击次数：625 发布时间：2013-03-10 |
| 本试剂盒仅供研究使用
特异性：本试剂盒可检测牛甘胆酸，且与其他相关物质无交叉反应。
有效期：6个月
预期应用：ELISA法定量测定牛血清、血浆或其它相关生物液体中甘胆酸含量。
说明
1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。
2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。
4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。
实验原理
本试剂盒采用酶联免疫间接竞争法检测甘胆酸。微孔板上包被有甘胆酸偶联物。加入甘胆酸抗体和甘胆酸标准品或样品，游离甘胆酸与微量反应板上的甘胆酸结合物竞争结合抗甘胆酸抗体，没有结合的抗体被洗去，再向微孔中加辣根过氧化物酶标记二抗，与结合在反应板上的抗体作用一定时间，洗去多余的辣根过氧化物酶标记二抗。再向反应孔中加入相应反应底物TMB，作用一定时间后，结合的酶结合物将TMB转化为蓝色，转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的甘胆酸呈负相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
试剂盒组成及试剂配制
1. 已包被甘胆酸偶联物的酶联板（Assay plate ）：一块（96孔）。
2. 标准品（Standard）：2×250ul/瓶。
3. 样品稀释液（Sample Diluent）：2×20ml/瓶。
4. 甘胆酸单克隆抗体：1×60μl/瓶（1：100）
5. 辣根过氧化物酶标记二抗（HRP-anti-antibody ）：1×120μl/瓶（1：100）
6. 底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。
7. 浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。
8. 终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。
需要而未提供的试剂和器材
1. 标准规格酶标仪
2. 高速离心机
3. 电热恒温培养箱
4. 超声清洗器
5. 离子交换小柱（PCX）
6. 氮气吹干仪
7. 干净的试管和Eppendof管
8. 系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，用多通道移液器
9. 蒸馏水，容量瓶等
标本的稀释原则：
首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量，确定适当的稀释倍数。只有稀释至标准曲线的范围内，检测的结果才是准确的。稀释的过程中，应做好详细的记录。zui后计算浓度时，稀释了“N”倍，标本的浓度应再乘以“N”。
标准品的稀释原则：2瓶，每瓶浓度为1000 ng/ml，以样品稀释液做系列倍比稀释，分别稀释1000 ng/ml，500 ng/ml，250 ng/ml，125 ng/ml，62.5 ng/ml，31.2 ng/ml，15.6 ng/ml。样品稀释液直接作为标准浓度0 ng/ml。
甘胆酸抗体和辣根过氧化物酶标记二抗的稀释原则：
临用前以样品稀释液稀释，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（甘胆酸抗体每孔50ul，辣根过氧化物酶标记二抗每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如10ul甘胆酸抗体和辣根过氧化物酶标记二抗加990ul样品稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。
操作步骤
实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1. 酶联板使用前用洗液洗板2-3次，每次浸泡1-2分钟，250ul/每孔，甩干。
2. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标准品或待测样品50ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，然后在所有孔中加入50 ul 胆酸抗体工作液。尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。酶标板加上盖或覆膜，37℃反应30分钟（为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液）。
3. 温育后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，250ul/每孔，甩干。
4. 所有孔中加入100 ul辣根过氧化物酶标记二抗工作液。尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。酶标板加上盖或覆膜，37℃反应30分钟
5. 温育后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，250ul/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30分钟内，一般10-15分钟内，此时肉眼可见标准品的后3-4孔有明显的梯度蓝色，前3-4孔颜色不明显，即可终止）。
7. 依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。 在加终止液后15分钟以内进行检测。
注：
1. 用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心数分钟，以便试剂集中到管底。
2. 每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。测量时先用此孔调OD值至零。
3. 为防止样品蒸发，试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内，酶标板加上盖或覆膜。
4. 未使用完的酶标板或者试剂，请于2-8℃保存。标准品、甘胆酸抗体和辣根过氧化物酶标记二抗工作液请依据所需的量配置使用。请勿重复使用已稀释过的标准品、甘胆酸抗体和辣根过氧化物酶标记二抗工作液。
5. 建议检测样品时均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可触及板壁）或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。
自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
计算
以标准物的浓度为横坐标（对数坐标），OD值为纵坐标（普通坐标），在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1. 当混合蛋白溶液时应尽量轻缓，避免起泡。
2. 洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。
3. 一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。
5. 如标本中待测物质含量过高，请先稀释后再测定，计算时请zui后乘以稀释倍数。
6. 在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的稀释液配制，不能混淆。
7. 底物请避光保存。
8. 不要用其它生产厂家的试剂替换试剂盒中的试剂。 | | | |
|
|
|
|
