一、原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物氯霉素和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗氯霉素抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物氯霉素的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应残留物氯霉素的含量。
二、试剂盒技术指标
试剂盒灵敏度： 0.05ppb
样本定量检测下限：
肠 衣————————————————0.1ppb 蜂 蜜———————————————— 0.1ppb
牛 奶————————————————0.05ppb
尿液、血清——————————————0.1ppb
组织、肝脏————————————— 0.025ppb
饲 料———————————————0.15ppb
样本回收率：
组织、肝脏—————————————80%±10%
蜂蜜、肠衣—————————————70%±10%
牛奶、饲料—————————————85%±15%
尿液、血清———————————————70%±10%
交叉反应率
氯霉素———————————————————100%
甲砜霉素————————————————— < 0.1%
氟甲砜霉素————————————————< 0.1%
三、 试剂盒组成
1、 微量测试孔：每条8孔，一板12条
2、 标准液X6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb
3、 酶标记物 12ml………………红色帽
4、 抗体浓缩液 1ml…………………蓝色帽
5、 底物 A 液 7ml……………… 白色帽
6、 底物 B 液 7 ml……………… 黑色帽
7、 终止液 7 ml……………… 黄色帽
8、 20X浓缩洗涤液 40ml………………白色帽
9、 2X浓缩复溶液 50ml………………透明帽
四、所用仪器、试剂
具备的仪器：微孔板酶标仪、氮气吹干装置、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g ）
微量移液器：单道 20µl-200µl、100µl-1000µl、多道 250µl
试 剂：乙酸乙酯、乙腈、正己烷、去离子水、亚硝基铁、硫酸锌、葡萄糖苷酸酶（Merck,Art.No.4114）、醋酸钠、醋酸
五、样本前处理步骤
样本处理前须知
处理任何样本时，都必须注意：
（a）本试剂盒所检测的组织样本包括：动物组织、
禽类和水产组织。eg:鸡、鸭、牛、兔、鱼、虾等。
（b）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（c）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染，干扰实验结果。
样本前处理需配制：
配液1、C液（牛奶样本使用）：
0.36M 亚硝基铁（Na2Fe（CN）5·NO·2H2O）10.7g亚硝基铁加去离子水100ml溶解。
配液2、D液（牛奶样本使用）：
1M硫酸锌（ZnSO4·7H2O）28.8g硫酸锌加去离子水100ml溶解。
配液3、 pH4.8 100mM醋酸钠缓冲液（尿样本使用）：称2.4g醋酸钠和1.2ml醋酸加去离子水500ml溶解混合。
配液4、乙腈-水溶液 V乙腈：VH2O＝84：16
配液5、将2X浓缩复溶液用去离子水按1：1稀释。（1份浓缩复溶掖+1份去离子水，用于抗体的稀释和样本提取后的复溶）。
（a）组织、肝脏样本前处理方法
1、 用均质器均质组织样本；
2、 称3±0.05g样本于离心管中，先加入3ml去离子水充分混匀再加入6ml乙酸乙酯，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min；
3、 取出4ml上层液体在氮气流50-60℃水浴中干燥；
4、 加入1 ml正己烷溶解干燥的残留物，再加1ml稀释后的复溶液强烈振荡混合30s，室温4000r/min以上离心5min。
5、 取50 µl下层相用于分析。
样本稀释倍数：0.5
（b）血清血浆
1、 取1ml血清或血浆至试管中，加2ml乙酸乙酯振荡1min；
2、 静置使水相与有机相分层或室温4000r/min离心5min；
3、 移取上层的乙酸乙酯至另一试管中，用氮气流50℃水浴中干燥；
4、 残留物用1 ml稀释后的复溶液溶解，混合30s；
5、 取50µl用于分析。
样本稀释倍数：1
（c）尿液
1、 移取2ml尿液到离心管中，加pH4.8 100mM醋酸钠缓冲液0.5ml混合；
2、 加40µl葡萄糖苷酸酶（Merck,Art.No.4114）到稀释的尿液中，在37℃水解至少2小时（或过夜）；
3、 该溶液恢复至室温后加入8ml乙酸乙酯混合1min；
4、 室温4000r/min离心10min，取出4ml上层液体在氮气下50～60℃干燥；
5、 用1ml稀释后的复溶液溶解干燥的残留物，混合30s；
6、 取50µl 用于分析。
样本稀释倍数：1
（d）蜂蜜
1、 取2±0.05 g蜂蜜，放入离心管中，用4ml
去离子水溶解；
2、 加入4ml乙酸乙酯上下振荡5min；
3、 室温4000r/min以上离心10min；
4、 移取2ml上层清澈液到另一离心管中，50-60℃氮气流下干燥；
5、 用0.5ml稀释后的复溶液溶解，混合30s；
6、 取50 µl用于分析。
样本稀释倍数：0.5 检测下限：0.025ppb
定量下限：0.1 ppb
注：我们推荐0.1 ppb为阳性样本的cut off值。
（e）肠衣
1、 用均质器均质样本注：干样本需剪碎（长度不超5mm）后再均质，湿样本需用去离子水漂洗20min以上（去除表面的盐份），沥干后再进行均质。
2、 称1±0.05g均质后的样本于离心管中，加入10ml乙酸乙酯，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min。
3、 取出5ml上层液体（相当于0.5g的样本）在氮气流下50-60℃干燥。
4、 加入1 ml正己烷溶解干燥的残留物，再加0.5ml稀释后的复溶液强烈振荡混合30s，室温4000r/min以上，离心5min。
5、 去上层相，取下层50 µl用于分析。
样本稀释倍数：1
（f）牛奶和奶粉
牛奶样本处理方法一
1、 牛奶样本，10℃4000r/min以上离心10min，吸除上层脂肪；
2、 取5ml去除脂肪奶样至离心管中，加入150µlC液出现沉淀，短暂振荡后加入150µlD液混合；
3、 15℃4000r/min以上，离心10min，移取上层液；
4、 用稀释后的复溶液以等体积稀释上层液，混合30s；
5、 取50µl用于分析。
注：如果离心后仍然浑浊，再重复沉淀过程。
样本稀释倍数：2 检测下限：0.1ppb
定量下限：0.15ppb
牛奶样本处理方法二
1、 取5ml去除脂肪奶样至离心管中；
2、 加入250µlC液和250µlD液*混合，4-12℃4000r/min以上离心10min。如果没有冷冻离心机，请预先将样本冷却到8℃；
3、 转移出2.2ml上层液（相当于2ml奶样）至一
个新的离心管中，加入4ml乙酸乙酯上下振荡5min；
4、 室温（20-25℃）4000r/min以上离心10min ；
5、 转移出2ml乙酸乙酯上层液体（相当于1ml奶样），60℃氮气流下*干燥；
6、 用0.5ml稀释后的复溶液溶解干燥的残留物，混合30s；
7、 取50µl用于分析。
样本稀释倍数：0.5 检测下限：0.025ppb
定量检测限：0.05ppb
由于阴性样本可能会产生背景干扰 （在某些
情况下干扰数值在标准2到3之间），所以推荐标准3作为阳性结果的CUT OFF判断值。
奶粉样本处理方法
1、 称2±0.05 g奶粉至离心管中，加入10ml去离子水，振荡溶解；
2、 加1ml C液和1ml D液*混合。4-12℃4000r/min以上离心10min。若无冷冻离心机，请预先将样本冷却到8℃；
3、 转移出3.6ml上层液（相当于0.6g奶粉）至一
个新的离心管中，加入6ml乙酸乙酯上下来回
振荡5min；
4、 室温（20-25℃）4000r/min以上离心10min；
5、 转移出4ml乙酸乙酯上层液体（相当于0.4g奶粉），60℃氮气流下*干燥；
6、 用0.4ml稀释后的复溶液溶解干燥的残留物，混合30s；
7、 取50µl用于分析。
样本稀释倍数：1 检测下限：0.05ppb
定量检测限：0.15ppb
由于阴性样本可能会产生背景干扰 （在某些情况下干扰数值在标准2到3之间），所以推荐标准3作为阳性结果的CUT OFF判断值。
（g）蛋类
1、 用均质器低速均质样本（蛋黄或全蛋）；
2、 称取3±0.05 g均质过的样本，与9ml乙腈-水溶液（84︰16；V乙腈︰V水）振荡5min，15℃ 4000r/min以上离心10min；
3、 取3ml上层与3ml蒸馏水混合，加入4.5ml 乙酸乙酯混合5min，15℃4000r/min以上离心10min；
4、 将上层有机相转移到试管中50℃下氮气吹干；
5、 加入1ml正己烷溶解残留物后，用2ml稀释后的复溶液混合30s，离心去除正己烷。
6、 取50µl用于分析。
样本稀释倍数：2 检测下限：0.1ppb
定量检测限：0.3ppb
（h）饲料
1、 称取2±0.05g均质过的饲料样本，加入2ml去离子水，再加入6ml乙酸乙酯，充分振荡2min，15℃ 4000r/min以上离心10min；
2、 取2ml上层有机相到试管中56℃下氮气吹干；
3、 加入1ml正己烷溶解残留物，用1ml稀释后的复溶液混合30s，离心去除上层正己烷。
4、 取50µl用于分析。
样本稀释倍数：3 检测下限：0.15ppb
六、 酶标免疫分析程序
测定前应须知：
1、 使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25℃）。
2、 使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3、 在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
4、 在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。
操作步骤
1、 从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、 取出需要数量的微孔及框架，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。
4、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5、 将浓缩抗体用已稀释好的复溶液11倍稀释（1份抗体加入10份稀释液，按需配制使用）
6、 加标准品/样本 50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。25℃环境中反应30min。
7、 取出将孔内液体甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
8、 每孔加入酶标记物100µl，盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4-5遍（同上），用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
9、 显色：每孔加入底物A液50µl，再加底物B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。
10、测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。
七、结果判定
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与其所含氯霉素成反比。
1、 粗略判定：
用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围（ppb）。假设样本1的吸光度值为0.250，样本2的吸光度值为0.720，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.610；0.05ppb为1.380；0.15ppb为1.100；0.45ppb为0.620；1.35ppb为0.289；4.05ppb为0.108。则样本1的浓度范围是1.35ppb-4.05ppb；样本2的浓度范围是0.15 ppb-0.45 ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中氯霉素实际浓度。
2、 定量分析
（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以*个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光度值（%）＝B×100%
B0 B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值
（2）标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标，以氯霉素标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氯霉素实际浓度。若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（索取）
八、注意事项
1、 室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温
（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、 试剂混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、 不要使用过了有效期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。
6、 将不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、 试剂变质的迹象
显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5时，表示试剂可能变质。
8、 该试剂盒*反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
九、储藏条件和保质期
储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，不要冷冻。
保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。
提示：酶标板真空包装袋若有漏气，酶标板仍然正常有效，不影响实验结果，请放心使用。
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